ELISpot底板材質(zhì)的改進(jìn)

自1983年ELISPOT技術(shù)創(chuàng)立之初，檢測底板使用的是普通塑料板，但由于塑料板的蛋白吸附能力差，實(shí)驗的靈敏度有限，因此也限制了ELISpot技術(shù)的發(fā)展。1985年，Moller SA和Borrebaeck CA將硝酸纖維素膜作為底板，引入ELISPOT中用于檢測分泌抗體的陽性B細(xì)胞，獲得了遠(yuǎn)優(yōu)于塑料板的結(jié)果。

不過硝酸纖維素（包括醋酸纖維素）也有自身的不足。由于它是天然纖維素經(jīng)過人工酯化后獲得的，纖維排列不規(guī)則，膜表面平整度差，導(dǎo)致表面形成的斑點(diǎn)外形破碎，高低錯落，并且邊緣彌散。另外，纖維素還存在機(jī)械承受力差，化學(xué)穩(wěn)定性差，不利于長時間保存等缺點(diǎn)。

1995年，荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Schielen P團(tuán)隊把一種更優(yōu)于硝酸纖維素膜的PVDF膜引入了ELISPOT檢測中。PVDF是完全人工合成的，可以控制其纖維的長度與排列方式，從而獲得幾乎完美的膜結(jié)構(gòu)。相比硝酸纖維素膜，PVDF膜具有更優(yōu)的蛋白吸附性質(zhì)，更加均勻的膜結(jié)構(gòu)以及更加精細(xì)的顯色條帶分辨率。因此，PVDF的引入是繼硝酸纖維素膜之后，ELISPOT底板材料的又一次重大突破。至今，除了BD公司還在沿用硝酸纖維素膜板外，其余全球所有的ELISpot試劑公司都用PVDF膜取代了硝酸纖維素膜。

PVDF膜的乙醇活化

由于PVDF膜是疏水性的，因此在使用前須用乙醇潤濕后才能使用。酒精活化的PVDF膜板可以顯著強(qiáng)化斑點(diǎn)的清晰度和可讀性，增加斑點(diǎn)數(shù)量，提高ELISPot檢測的靈敏度。

乙醇活化PVDF膜的快速指南

■乙醇活化—乙醇的濃度和加入的時間是關(guān)鍵

☆MSIP和IPFL板：每孔加入15 μl 35%的乙醇溶液，潤濕時間不超過1 min；

☆MAIPSWU板：每孔加入50 μl 70%的乙醇溶液，潤濕時間不超過2 min；

■板子的清洗：每孔加入200 μl的無菌水進(jìn)行清洗，重復(fù)5次。

■加入包被抗體：每孔加入100 μl PBS稀釋好的包被抗體，4℃包被過夜。

乙醇活化PVDF膜的注意事項：

■未潤濕的PVDF膜是潔白，不透明的；經(jīng)乙醇潤濕后，顏色變暗，呈半透明狀，很容易觀察二者的區(qū)別。

■加乙醇時，槍頭應(yīng)該靠在孔壁接近孔底的地方，注意槍頭不要刺到PVDF膜。

■ 若加入的乙醇掛在孔壁上，蓋上板蓋，輕輕叩擊，讓乙醇順勢滑落。乙醇一旦接觸到PVDF膜，就會在表面張力和毛細(xì)作用下迅速浸潤整塊膜，使得膜的顏色和透明度發(fā)生變化。

■乙醇加入的體積是經(jīng)過優(yōu)化的，請勿隨意加大或減少用量。

■膜在潤濕后避免過長時間的孵育，因為酒精的揮發(fā)會導(dǎo)致膜的高疏水性。

■預(yù)濕后的乙醇必須被有效的清洗掉，因為殘留的乙醇會干擾斑點(diǎn)的形成。

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